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18 2026.04
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TOC法测定中药提取物清洁验证的研究
中药的组成元素既繁多又不易识别，其相关成分的浓度也难以准确测量。目前，针对中药制剂的残留活性的清洁度检测手段各异，大部分的检测手段是使用化学药物的清洁度检测，并且主要使用有效成分来衡量其残留活性[1-3]。总有机碳法(简称TOC法)的检测原理是通过将供试品中的有机物氧化分解成CO2,通过非分散红外检测器检测CO2的浓度值，属于有机物的非专属性检测方法。与其他方法(如：HPLC法、UV法、电导率法等)比较，TOC法具有灵敏度高、时间快、检验成本低等优点。中药制剂的组成元素虽繁多，但有机物质主要含有生物碱、糖、有机酸等成分。目前TOC法一般多用于纯化水和注射用水的检测。TOC法通过氧化水中的有机物，使有机物中的碳转化为CO2,通过检测产生CO2的量，从而计算水中有机物的量。TOC法是一种直接测量水中有机污染物的方法，以含C量表示水体中有机物质总量的综合性指标。由此推出，TOC法可以用于中药制剂的清洁验证[4-5],以双花百合片为例，采用总固体为活性成分[3],并建立TOC法清洁验证残留标准。
1 概论
扬子江药业集团江苏制药股份有限公司以生产中药为主，由于公司中药新产品的引进，中药品种逐年增加，新产品PDE(前一产品的允许日暴露量)没有数据，现有方法基本采用化药清洁验证模式，残留活性成分主要采用有效成分作为指标，而中药提取物成分复杂、不明确，有关成分的含量难以测定。
扬子江药业集团江苏制药股份有限公司参与配方颗粒业务，品种数量达300个以上，参照化药清洁验证模式进行清洁效果检查，90%以上采用HPLC法进行测定，工作难度增加，对照品消耗大，分析时间长，为减少工作量、降低检验成本，需增加新的清洁验证方法并确定清洁验证限度标准。因此需增加新的清洁验证方法并确定清洁验证限度标准。
通过讨论提出构想：能否通过创新其他方法快速进行中药提取物清洁验证?为此，通过查找网站进行相关文献检索，记载了相关TOC方法。
总有机碳(TOC)检测分析所依循的原理为：将供试品当中的有机物进行氧化分解，转化为CO2,而后借助非分散红外检测器对CO2的浓度值加以检测，这归为有机物的一种非专门属性的检测手段[4]。
TOC法对醇较为敏锐。在中药生产当中，特别是有的提取步骤需要用醇来提取，或者使用不同浓度的乙醇加以清洁，运用TOC法来检验有可能会出现状况。然而，TOC法能够比较精确地确定水中有机物有无超出标准，从而达到检测水质的要求，因此此次攻关品种选择水提取的双花百合片品种。
2 接受标准及限度值确定
2.1 取样方法选择
通常取样方法有两种：直接取样法(擦拭取样法)和淋洗取样法。从适用范围、缺点及注意事项进行分析比较，如表1所示。
表1取样方法选择
| 项目 | 直接取样法(擦拭取样法) | 淋洗取样法 |
| 适用范围 | 设备表面直接取样进行分析，判断设备表面清洁与否，适用于设备内干燥不溶物的取样 | 用于表面积大、无法触及或无法常规拆卸的系统 |
| 缺点 | 必须拆卸设备才能接触到取样部位 | 不适用于残留物不溶或沉积于设备某个部位的情况 |
| 注意事项 | 使用前检查取样材料的清洁水平 | 一般取最后一次淋洗液样品分析 |
从适用范围上选择：设备表面运用直接取样法(擦拭取样法),淋洗取样法被用于那些表面积大、无法触及或者无法正常拆卸的系统，通常会把二者结合起来作为取样的方式。
使用擦拭法时，容易受到擦拭工具本身溶解的干扰。小组成员按照扬子江药业集团江苏制药股份有限公司《清洁验证管理规程》中规定的方法擦拭钢板表面(如图1),对空白擦拭用工具利用TOC仪进行现场实验结果：自制棉球TOC值为0.240×10-6,棉签TOC值为0.120×10-6,TX系列棉签TOC值为0.085×10-6,最终确定选用TX系列的715型号作为擦拭棉签。
图1钢板表面擦拭路径
2.2 限度值计算方法选择
选取活性高、清洁难度颇高[6]、溶解度最小同时颜色深的双花百合片作为代表产品；提出2种TOC总有机碳法建立中药提取物清洁验证的标准，并对该2种方法进行讨论分析，具体如下：
方案一：生物活性的限度[7]计算：
生物活性的限度计算通常采用基于日治疗量的计算标准[3,8]以及基于通用的标准总残留量进行计算。具体来说：基于日治疗量的计算标准是通过前一产品的最小单剂量与后一产品的最大日服用量来确定总残留量，即最大允许携带量(MACO)。而基于通用的标准总残留量的计算则是根据产品活性成分在后续产品中出现不超过10 mg/kg的要求进行。
在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的计算方法，并结合其他因素进行综合考虑，以确保清洁验证的有效性和安全性。同时，还需要注意不同监管机构可能对清洁残留限度的计算方式有不同的要求，因此在进行清洁验证时，需要遵循相应的法规和指南。
其中前一产品为A,后一产品为B(B1批量1 050 kg、B2批量1 190 kg、B3批量1 180 kg),MSD(A)为5 000 mg, MDD(B)为15 000 mg, SF=1 000,通过计算后一产品中总残留量分别为：349 650,396 270,392 940 mg。
基于通用的标准总残留量(需明确产品活性成分在后续产品中的出现不得超过10 mg/kg)展开计算，后一产品批量B(B1批量1 177.5 kg、B2批量1 800 kg、B3批量2 000 kg),A品种中药提取物计算标准，比较A品种在后一产品中允许最小总残留量为11 775 mg, 故采用基于通用的标准总残留量。
方案二：数据积累(以目检为依据，不得有可见的残留物):
通过对22个样品批次进行TOC结果的数据积累，平均值为2.92×10-6。
2.3 建立TOC限度标准
活性物质一般按总固体残留计算。考察双花百合片品种清膏C(mg/mL)与TOC值之间的关系，通过对样品TOC值的分析，可以得到样本平均值TOCx,及样本标准偏差σ。根据公式：A=(TOCx-4σ)/C,式中：A为目标物质碳百分含量；TOCx为样本结果平均值；σ标准偏差；C表示目标物质的浓度。
通过对1份样品的3次平行测定结果进行确定样品浓度与TOC值之间的对应关系。在测试之前，应当先构建目标化合物浓度和实测TOC值的线性关系，以此对清洁验证样品中目标化合物的含量予以评价，如表2所示。
表2目标化合物浓度确定
| 质量浓度/(mg·mL-1) | TOC值/(×10-6) |
| 0.1 | 0.073 |
| 0.3 | 0.308 |
| 0.5 | 1.98 |
| 0.7 | 2.79 |
| 1.0 | 5.51 |
| 1.2 | 6.89 |
从计算方式及仪器检测限度出发，小组成员最终确定质量浓度C约1.0 mg/mL。
选取30批样品，分别配制0.995 5 mg/mL的水溶液，分别进行测试计算碳，检测其TOC值(单位：×10-6),检测结果如表3所示。
表3 A品种30批清膏TOC值
| 号 | 批号 | TOC值 | 编号 | 批号 | TOC值 | 编号 | 批号 | TOC值 |
| 1 | 21091324 | 5.46 | 11 | 21072923 | 5.71 | 21 | 21082421 | 5.68 |
| 2 | 21091221 | 5.51 | 12 | 21091222 | 5.41 | 22 | 21091022 | 5.52 |
| 3 | 21091322 | 5.40 | 13 | 21090721 | 5.47 | 23 | 21080221 | 5.49 |
| 4 | 21090821 | 5.41 | 14 | 21081021 | 5.53 | 24 | 21091323 | 5.32 |
| 5 | 21091021 | 5.45 | 15 | 21090722 | 5.46 | 25 | 21080322 | 5.39 |
| 6 | 21080323 | 5.54 | 16 | 21072923 | 5.68 | 26 | 21080321 | 5.36 |
| 7 | 21080324 | 5.59 | 17 | 21091321 | 5.52 | 27 | 21073121 | 5.47 |
| 8 | 21090822 | 5.44 | 18 | 21091421 | 5.49 | 28 | 21072921 | 5.46 |
| 9 | 21082222 | 5.38 | 19 | 21070522 | 5.32 | 29 | 21073022 | 5.24 |
| 10 | 21082321 | 5.57 | 20 | 21090724 | 5.39 | 30 | 21073021 | 5.28 |
基于通用的标准总残留量：通常，待清除产品(前一产品)活性成分在后续产品中出现不超过10 mg/kg[7]。双花百合片中药提取物清洁验证按照通用的标准计算，在B中总残留量为11 775 mg。
残留限度为最小总残留与接触面积的比值。当物料与设备表面的最大接触面积增大时，单位面积的活性成分残留量降低，检测灵敏度则需提升[3],并依据后一产品中允许残留的总量较小值来核算不同设备被允许的残留限，如表4所示：
表4 A品种清洁验证残留限度
| 前一产品 | 设备名称 | 总接触面积/cm2 | 残留限度/[mg·(100 cm2)-1] |
| 醇沉罐 | 147 790.90 | 7.97 | |
| 直通过滤器 | 53 407.60 | 22.05 | |
| 提取液储罐 | 186 150.35 | 6.32 | |
| A品种(总量11775 mg) | 平衡型双效浓缩器 | 1 006 216.47 | 1.17 |
| 单效节能浓缩器 | 434 538.87 | 4.59 | |
| 真空球形浓缩器 | 62 908.62 | 18.71 |
最小允许残留量为1.17 mg/(100 cm2),每100 cm2的面积上残留物用1 177.5 mL超纯水溶解，得到的最低残留限度：
Ld=1.17 mg/1 177.5 mL=0.000 993 6 mg/mL=0.993 6×10-6(1)
根据目标物质碳百分含量[3,9],即可得到清洁验证TOC限度值：
B=Ld×A=0.993 6×505.27%=5.02×10-6(2)
式中：B代表清洁验证TOC限度值；
A代表目标物质碳百分含量。
结论：TOC限度值为5.02×10-6。
3 相关仪器及试剂
3.1 仪器
总有机碳分析仪(GE Sievers 900);高效液相色谱仪(Agilent 1260);色谱工作站(OpenLab CDS2);电子天平(Mettler Toledo XPE205)。
3.2 试剂
蔗糖对照品(批号：111507-202105),磷酸(批号：20201112),碳酸钠(批号：20210514),TOC系统适用性溶液(批号：21136-0014、21133-0012、21281-0028),Milli-Q超纯水。
3.3 供试样品
双花百合片提取物(生产厂家：扬子江药业集团江苏制药股份有限公司，批号：21061011、21061511、21061911、21062411、21062911)。
3.4 方法与结果
TOC法作为一种分析检测的方法，只有通过方法学的验证才能够被用于实际检测[6]。人用药物注册技术要求国际协调会对于方法学实验的相应指导原则简称为ICHQ2B,为其规定了实验内容。本文以双花百合片提取物为例，就TOC法测定清洁验证的线性、精密度、准确度(加标回收率)、检测限与定量限、稳定性、耐用性、取样回收率等实施方法学验证[7]。
3.4.1 线性
3.4.1.1 线性溶液的配制
运用适量的蔗糖对照品(批号：111507-202105,中国食品药品检定研究院),添入适量超纯水予以溶解，定容，配置成TOC质量浓度大约为50 mg/L的标准溶液，以纯化水分别稀释合适的倍数，测定超纯水空白与稀释后溶液的TOC值。
3.4.1.2 结果
超纯水空白为103 μg/L,以质量浓度x轴，测定值为y轴，线性方程为y=1.005 8x, 线性范围为：50～25 000 μg/L,相关系数为R=0.999 2,如图2所示。
图2 TOC线性
3.4.2 精密度
3.4.2.1 精密度溶液配制
取双花百合片提取物，使用规定的TOC擦拭专用棉签按照扬子江药业集团江苏制药股份有限公司《清洁验证管理规程》中规定的方法擦拭钢板表面(如图1),将棉签折断于装有40 mL超纯水的低TOC取样瓶中，备用；连续检验6次。
3.4.2.2 结果
制备1份清洁验证样品，连续6次TOC检测，检验结果如表5所示。
表5精密度实验结果
| 样品编号 | 结果/(×10-6) |
| 1 | 1.10 |
| 2 | 1.10 |
| 3 | 1.11 |
| 4 | 1.11 |
| 5 | 1.10 |
| 6 | 1.11 |
| RSD/% | 0.5 |
3.4.3 重复性
3.4.3.1 重复性溶液配制
取双花百合片提取物6份，采用规定的TOC擦拭专用棉签按照图1的方式擦拭钢板表面，将棉签折断置于装有40 mL超纯水的低TOC取样瓶里，备用。
3.4.3.2 结果
制备6份清洁验证样品，依次进行TOC检测，检验结果如表6所示。
表6重复性实验结果
| 样品编号 | 结果/(×10-6) |
| 1 | 1.12 |
| 2 | 1.13 |
| 3 | 1.13 |
| 4 | 1.13 |
| 5 | 1.13 |
| 6 | 1.13 |
| RSD/% | 0.4 |
3.4.4 回收率
3.4.4.1 加标回收率
加标回收率溶液制备及结果：检测6份双花百合片提取物样品的总有机碳浓度，加入50 mg/L蔗糖溶液3 mL至100 mL量瓶中，计算回收率与回收率RSD。
回收率=[样品实测含量-样品理论含量]/理论加入量×100%;样品理论含量=取样量×样品理论浓度；理论加入量：回收率样品溶液中对照品的理论加入量。
6份清洁验证样品，依次进行TOC检测，检验结果如表7所示。
表7加标回收率实验结果
| 序号 | 样品实测含量/(×10-6) | 样品理论含量/(×10-6) | 理论加入量 | 回收率/% |
| 1 | 3.48 | 2.08 | 93.3 | |
| 2 | 3.43 | 2.08 | 90.0 | |
| 3 | 3.41 | 2.08 | 50 mg/L蔗糖溶液3 mL至100 mL量瓶中 | 88.7 |
| 4 | 3.38 | 2.08 | 86.7 | |
| 5 | 3.34 | 2.08 | 84.0 | |
| 6 | 3.36 | 2.08 | 85.3 |
1)取样回收率样品制备：选取生产设备表面材质相同的钢板，其面积为10 cm×10 cm, 共6块。分别向这6块钢板滴加100 μL,200 μL,500 μL,750 μL,1 mL,1.5 mL 配制好的样品溶液，待其自行晾干后，运用规定的TOC擦拭专用棉签按照规定方法擦拭钢板表面，把棉签放入装有40 mL超纯水的低TOC取样瓶中，并分别编号。分别取相同量的样品溶液放置在装有空白擦拭棉签与40 mL超纯水的低TOC取样瓶中，进行上样检测总有机碳质量浓度，进而计算擦拭回收率。
2)结果：分别对加入100 μL,200 μL,500 μL,750 μL,1 mL,1.5 mL溶液分别编为样品1～6及擦拭后样品进行TOC检验，结果如表8所示。
表8取样回收率实验结果
| 品名 | 实测结果/(×10-9) | 擦拭结果/(×10-9) | 回收率/% |
| 样品1 | 419 | 352 | 84.0 |
| 样品2 | 472 | 415 | 87.9 |
| 样品3 | 638 | 606 | 95.0 |
| 样品4 | 774 | 747 | 96.5 |
| 样品5 | 889 | 861 | 96.9 |
| 样品6 | 1 190 | 1 180 | 99.2 |
3.4.5 检测限与定量限
3.4.5.1 检测限与定量限溶液的制备
针对空白超纯水溶液开展10次检测，算出10次检测结果的标准偏差SD。计算公式：检测限LOD=3.3SD/k,定量限LOQ=10SD/k,其中：SD标准偏差，k为线性方程的斜率。
3.4.5.2 结果
空白超纯水溶液，进行10次TOC检测，结果为：空白超纯水样品标准偏差为0.6%,检测限为3.03 μg/L,定量限为9.18 μg/L。
3.4.6 稳定性
3.4.6.1 稳定性样品制备
取双花百合片提取物清洁验证样品，分别于0,2,4,6,8,44 h进行TOC检测。观察结果变化。
3.4.6.2 结果
双花百合片提取物清洁验证样品，分别按照规定时间进行TOC检测，检验结果如表9所示。
表9稳定性实验结果
| 时间/h | 结果/(×10-6) |
| 0 | 1.12 |
| 2 | 1.13 |
| 4 | 1.10 |
| 6 | 1.10 |
| 8 | 1.10 |
| 44 | 1.06 |
3.4.7 耐用性
3.4.7.1 耐用性溶液制备
分别取500×10-9蔗糖溶液与1,4-对苯醌溶液，分别用磷酸和碳酸钠将样品pH值分别调为4,7,10,之后进行TOC检测，用以观察结果的变化状况。
3.4.7.2 结果
调节pH值后样品进行TOC检测，检验结果如表10所示。
表10耐用性实验结果
| pH值 | 蔗糖对照品结果×10-9 | 1,4-对苯醌对照品结果×10-9 |
| 4 | 581 | 577 |
| 7 | 611 | 609 |
| 10 | 605 | 600 |
TOC法检验清洁验证样品各项验证结果都满足方法学验证的规定[10],擦拭回收率的验证证实了这一取样方法对双花百合片提取物具有较好的回收率，证明TOC法可以用于检验双花百合片提取物的清洁验证。
3.4.8 TOC法与HPLC法检验清洁验证结果对比
目前，我公司双花百合片提取物采用高效液相色谱仪法，对双花百合片提取物中盐酸小檗碱的有效成分进行定量检测，其检测限为20 μg/L,HPLC法应用于定量检测能够达到预期的检验效果，但用于清洁验证这种痕量检测存在一定的局限性，HPLC方法的灵敏度达不到要求，且仅对检测物有响应，无法满足对所有有机碳的残留量进行检测。
通过对连续5批双花百合片提取物清洁验证样品进行TOC法与HPLC法检验，比较结果如表11所示。
表11 TOC法与HPLC法结果比较
| 品名 | 批号 | TOC法/(×10-6) | HPLC法 |
| 空白溶液 | 0.25 | 未出峰 | |
| 21061011 | 1.13 | 未出峰 | |
| 21061511 | 1.15 | 未出峰 | |
| 双花百合片提取物 | 21061911 | 1.14 | 峰形小，难于定量 |
| 21062411 | 1.16 | 未出峰 | |
| 21062911 | 1.15 | 峰形小，难于定量 |
通过以上分析，TOC法检验清洁验证样品，可以真实地反映出清洁效果，可以检测到5批双花百合片提取物清洁验证样品；TOC法可以准确、科学、高效地评价清洁验证效果。
4 讨论
通过以上对双花百合片提取物为例进行清洁验证方法学实验证实，TOC法可以用于中药产品的清洁验证，但同时也存在弊端。需注意的是，在使用TOC法进行清洁验证或其他检测时，应充分考虑样品的特性和检测目的，以确保检测结果的准确性和可靠性。对于含有乙醇或不溶性成分的情况，可能需要结合其他检测方法或对样品进行适当处理，以获得更全面和准确的分析结果[5,9]。同时，在建立残留标准的计算方法时，需严格按照相关的规范和要求进行操作，并进行充分的方法验证。综上所述，TOC法可以很好地评价水溶性中药产品清洁验证效果。综上所述，TOC法可以很好地评价水溶性中药产品清洁验证效果。
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