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总有机碳(TOC)在注射液清洁验证中的应用
2010版GMP中要求:制药企业的生产设备应制定详细的使用和清洁操作规程,清洁方法应当经过验证,证实其清洁效果,以有效防止污染和交叉污染。清洁验证应当综合考虑设备使用情况、所使用的清洁剂和消毒剂、取样方法、取样位置以及相应的取样回收率、残留物的性质和限度、残留物检验方法的灵敏度等因素[1]。硫酸依替米星氯化钠注射液为大容量注射液,实际生产中采用检测淋洗水中残留物的方法来验证生产后配料系统的清洁效果。清洁验证样品(淋洗水)中活性物质(硫酸依替米星)的最高允许残留限度为10×10-6,即10μg/m L[2]。
硫酸依替米星为氨基糖苷类抗生素,对静止期细菌的杀灭作用强,抗菌谱广,抑菌杀菌力强,毒副作用小,化学稳定性好。因其在紫外-可见光波长范围内无吸收,中国药典2015版针对原料采用的检测方法为HPLC-ELSD法和HPLC-积分脉冲安培电化学检测法。考虑到方法的灵敏度和耐用性,对于浓度更低、成分更复杂的硫酸依替米星注射液的检测只采用HPLC-ELSD法[3]。
在硫酸依替米星氯化钠注射液的清洁验证中,除了HPLC-ELSD法之外,总有机碳(TOC)也是备选方法之一。总有机碳通过检测水中含碳有机物的量,来判断清洁过程是否使污染物的残留降到最高允许限度以下。因其不仅可以检测特定活性成分也可以检测辅料、杂质等的残留,在制药行业的清洁验证中也越来越受到重视。本文通过灵敏度和可操作性等指标对HPLC-ELSD法和TOC法进行筛选,并进行方法学验证。
1 方法筛选
以检测方法的灵敏度为主要指标进行方法筛选。
1.1 HPLC-ELSD法检测灵敏度
色谱条件:用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂(pH范围0.8～8.0)(4.6 mm×300 mm,5μm或效能相当的色谱柱);以0.2 mol/L三氟醋酸溶液-甲醇(84∶16)为流动相;流速为每分钟0.5 m L;用蒸发光散射检测器检测(参考条件:漂移管温度为40℃,载气流速为2.6 L/min);进样量160μL。
样品配制:精密称取硫酸依替米星对照品约25mg置25 m L量瓶中,用0.5 mol/L三氟乙酸溶解并稀释制成1.0 mg/m L的溶液,逐级稀释。当信噪比约为3∶1时,相应的浓度确定为检测限(LOD)约为10时,相应的浓度确定为定量限(LOQ)。
可接受标准:6份LOQ溶液有关物质峰保留时间的RSD不大于2.0%,峰面积的RSD不大于15.0%。
结果见表1。
HPLC-ELSD法的检测限为0.91 mg/L,定量限为2.36 mg/L。
1.2 TOC法检测灵敏度
根据ICH Q2 R1分析方法验证指导原则,TOC的检测限和定量限可以根据响应和斜率的标准偏差来制定[4]。
检测限LOD=3.3σ/S;定量限LOQ=10σ/S
表1 HPLC-ELSD法检测限与定量限
Table 1 LOD and LOQ of HPLC-ELSD
σ=空白响应的标准偏差;S=校正曲线的斜率
通过检测空白溶液(注射用水)的TOC,得到其响应因子并计算偏差。结果见表2。
表2 TOC法空白溶液标准差
Table 2σof Blank solution
标准偏差σ为0.539μg/L,
斜率S为2.881(参考3.1线性项下的校准曲线斜率),
检测限为3.3×0.539/2.881=0.671μg/L
定量限为10×0.539/2.881=1.87μg/L
1.3 结论
两种方法的定量限、检测限结果见表3。
表3 HPLC-ELSD法和TOC法的定量限和检测限
Table 3 LOD and LOQ of HPLC-ELSD and TOC
TOC法的灵敏度远超出HPLC-ELSD法,且对于所有的有机化合物均能响应,不需要色谱系统,免除平衡时间,操作简单快捷。所以在硫酸依替米星氯化钠注射液清洁验证中选择TOC法作为检测残留物的方法。
2 TOC法方法学验证
2.1 线性
硫酸依替米星注射液淋洗水的最大允许残留限度为10μg/m L,拟定线性范围为的最低浓度应接近定量限,最高浓度为限度的140%。根据实际情况,线性溶液的范围为限度的2%～140%,分别为:2%,20%,40%,60%,80%,100%,120%,140%,换算成浓度即为:0.2,2,4,6,8,10,12,14μg/m L。
(1)溶液配制及测定
精密称取硫酸依替米星约25 mg,置100 m L量瓶中,加水使溶解并稀释至刻度,摇匀,作为溶液1。精密量取0.8 m L置100 m L量瓶中,加注射用水稀释至刻度,摇匀,作为限度20%溶液。再精密量取5m L置50 m L量瓶中,加注射用水稀释至刻度,摇匀,得到限度2%溶液。分别量取溶液1各1.6、2.4、3.2、4、4.8、5.6 m L,置100 m L量瓶中,加注射用水溶液稀释至刻度,得到限度40%,60%,80%,100%,120%,140%溶液,测定TOC,每份溶液测定3次。将硫酸依替米星浓度对TOC测定值做线性拟合,结果见表4。
硫酸依替米星称样量:25.04 mg。
表4 标准曲线溶液测定结果
Table 4 Results of standard curve solution
结论:相关系数>0.99,TOC测定结果与样品浓度存在良好的线性关系。
2.2 精密度
将浓度为10μg/m L的样品测定6次,计算RSD,应小于2%,结果见表5。
表5 精密度测定结果
Table 5 Precision test result
结论:6次样品测定结果的RSD<2.0%,说明TOC测定结果精密度良好。
2.3 准确度
硫酸依替米星的分子式为(C21H43N5O7)2·5H2SO4,相对分子量为1445.58。其中含碳百分比为:(12×21×2/1445.58)×100%=34.86%
例如:10μg/m L硫酸依替米星含碳的浓度应为3.486μg/m L,该浓度样品的TOC理论值应为3.486μg/m L+空白水样的TOC。
准确度=样品理论值/样品实测值×100%
选择限度60%、100%和140%的3个浓度,计算准确度。结果见表6。
表6 准确度测定结果
Table 6 Accuracy test result
方法的准确度为102.38%,说明TOC分析方法可以准确的测定淋洗水中的残留物含量。
3 三批产品清洁验证淋洗水残留物检测
测定硫酸依替米星氯化钠注射液配料系统清洁后的淋洗水,证明配料系统按程序清洗后,使用时上批产品不会对下批产品的质量产生影响。结果见表7。
数据表明,个批次间清洁验证样品TOC测定值比较稳定,且硫酸依替米星的浓度低于最大允许残留限度,配料系统清洁效果符合要求。
4 讨论
HPLC-ELSD检测残留物的方法引用国家药品标准WS1-XG-028-2015,考虑到清洁验证的样品,含量往往非常低,故在原标准基础上将进样量由80μL增加至160μL。为了排除溶剂效应对样品检测的影响,将样品用0.5 mol/L的三氟乙酸稀释[8]。根据灵敏度试验结果,HPLC-ELSD的定量限仅为mg/L级别,而TOC法可以达到μg/L。首先作为残留物检测手段,灵敏度是首要的考虑要素。其次,与HPLC法相比TOC法操作简单快捷,不需要系统平衡及后续处理,样品检测速度快。再者,TOC检测属于非专属性的检测法,可以检测除了活性物质之外样品中所有的含碳杂质均可被检测到。
表7 三批产品清洁验证检测结果
Table 7 Three batch of product cleanliness verification test results
对于制药企业,TOC法是可靠、合理、实用性强的测定清洁验证的样品的检测手段。
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